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抗(AbA)金擔(dān)子素A的酵母轉(zhuǎn)化操作方式
   (AbA)金擔(dān)子素A是從絲狀真菌Aureobasidiumpullulans No.R106中分離出來的環(huán)酯肽類抗生素,具有很強(qiáng)的抗真菌能力。 金擔(dān)子素A,Aureobasidin A(AbA)在較低的濃度下(0.1-0.5 μg/ml)即可對(duì)酵母產(chǎn)生毒性。對(duì)其敏感的真菌種類包括:出牙酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)和黑曲霉(A. niger.)。作用機(jī)制在于AbA抑制了真菌生長(zhǎng)所依賴的肌醇磷酰胺(inositol phosphorylceramide,IPC)合成酶的活性,干擾鞘脂合成,從而進(jìn)一步殺死菌株。編碼IPC合成酶的基因研究較多的有來自釀酒酵母菌的AUR1基因,以及構(gòu)巢曲霉的AURA基因,兩者具有同源性。通過對(duì)這些編碼基因進(jìn)行突變即可使得菌株對(duì)AbA產(chǎn)生抗性,如AUR1-C基因。

  (AbA)金擔(dān)子素A非常適合用作陽(yáng)性克隆子篩選用的藥物選擇性標(biāo)記。AbA抗性也是酵母單/雙雜交研究中理想的報(bào)告子。本品為溶于甲醇的AbA溶液,濃度為1 mg/ml。具體的工作濃度取決于宿主細(xì)胞的敏感度(見表1. AbA對(duì)各種酵母菌的低抑菌濃度(MIC))。

  (AbA)金擔(dān)子素A產(chǎn)品性質(zhì) 產(chǎn)品描述冰袋運(yùn)輸。4℃保存。

  (AbA)金擔(dān)子素A的操作步驟(抗(AbA)金擔(dān)子素A的酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng))

  1) 加入0.5 ml過夜培養(yǎng)的酵母到50 ml YPD培養(yǎng)基中(配方:1L液體培養(yǎng)基含有10g yeast extract,20g polypeptone, 20g D-glucose;固體培養(yǎng)基另外加入2%瓊脂;)。

  2) 30℃培養(yǎng)約6小時(shí),測(cè)定OD660為1~2。使用二倍體時(shí),測(cè)定OD660為2~4。

  3) 1,000×g離心5分鐘。

  4) 用10 ml Solution A(配方:100 mM Lithium acetate,10 mMTris-HCl pH7.5,1 mM EDTA)懸浮沉淀,1,000×g離心5分鐘。

  5) 用Solution A重懸沉淀,直到OD660為150。

  6) 在管內(nèi)分取100 μl細(xì)胞懸浮液,30℃培養(yǎng)1小時(shí)。

  7) 加入5μg載體(環(huán)狀或線性DNA)和150 μg Carrier DNA,100℃加熱10分鐘,迅速冷卻。

  注:pAUR101需使用線性DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化。使用環(huán)狀DNA會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率甚至轉(zhuǎn)化不成功。pAUR112和pAUR123需使用完整的質(zhì)粒DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

  8) 加入850 μl Solution B(配方:取40 g Polyethylene Glycol 4000溶于100 ml Solution A充分溶解,需要現(xiàn)用現(xiàn)配),輕輕混勻。

  9) 30℃培養(yǎng)30分鐘后,42℃培養(yǎng)15分鐘。

  10)室溫放置10分鐘。

  11)5,000 rpm離心1分鐘,用5 ml YPD培養(yǎng)基懸浮沉淀。

  12)30℃培養(yǎng)6小時(shí)~過夜。

  13)5,000~10,000 rpm離心,用1-10 ml 0.9% NaCl懸浮沉淀。

  14)在YPD選擇培養(yǎng)基平板(含有一定濃度的AbA,依菌株類型而定)上接種100μl細(xì)胞懸液。30℃培養(yǎng)3-4天后轉(zhuǎn)化完成。

  15)挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,和/或測(cè)定轉(zhuǎn)化效率(以每微克質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的菌落數(shù)來表示)。

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